DNA 電泳是(shi)分子生物學(xue)實驗(yan)的“基本功”，幾(ji)乎(hu)所有(you)科研人員都(dou)繞(rao)不開(kai)。雖然操作看(kan)似(si)簡單，但原理與細節(jie)不少，一旦忽視就可能導致條(tiao)帶模糊(hu)、結果(guo)失真(zhen)，甚至(zhi)實驗(yan)“全軍覆沒”。今天我們來拆解幾(ji)個常見的誤區，從理論到實踐(jian)，幫你真(zhen)正(zheng)理解電泳原理，少走彎路。

???原理回顧：DNA 為什么能“跑起來”？

DNA電泳過程示意(yi)圖

DNA 電泳依賴的是?電場驅動：帶(dai)負電(dian)荷的 DNA 分子在電(dian)場(chang)中向正極遷移(yi)。遷移(yi)速度(du)主要受以下因素影響(xiang)：

分子大小：小分子(zi) DNA 在(zai)凝膠孔隙中阻(zu)力小，遷移更快(kuai)。

瓊脂糖濃度：濃度(du)越(yue)高，凝膠網孔越(yue)密(mi)，分辨小分子的能(neng)力更強。

電壓與緩沖液：電(dian)壓過高(gao)會導致發熱，緩(huan)沖(chong)液離子濃度不當會影響電(dian)流與分辨率。

核酸構象：線性 DNA、超螺(luo)(luo)旋質粒(li)(li)、開環質粒(li)(li)遷移速度各不相同，超螺(luo)(luo)旋質粒(li)(li) > 線性 DNA > 開環質粒(li)(li)。

超螺旋質(zhi)粒（Supercoiled DNA）構象緊密，分子呈現高度(du)(du)壓(ya)縮(suo)狀態。在凝(ning)膠孔隙中受到的阻力最小 → 遷移(yi)速度(du)(du)最快。

線(xian)性 DNA（Linear DNA）構象伸(shen)展，遷移速度主要取決于(yu)分子大小。一般情(qing)況下，速度介于(yu)超螺旋和開環之間。

開環質粒（Nicked/Relaxed Circular DNA）因(yin)單鏈切口導致(zhi)環形松弛，構(gou)象最(zui)“蓬松”。在凝膠中阻力最(zui)大 → 遷(qian)移速度最(zui)慢。

理解這(zhe)些原理，才能真正避免(mian)實驗(yan)中“看(kan)不懂(dong)”的現象。

???常見誤區一：瓊脂糖濃度隨意配

瓊脂糖(tang)是(shi)從海(hai)藻中提取的(de)(de)一(yi)種線性聚(ju)合(he)物，加熱溶(rong)解后再冷卻會形成具有網狀結構的(de)(de)凝(ning)膠。這個(ge)網絡就(jiu)像一(yi)個(ge)個(ge)篩(shai)孔。

瓊脂糖濃度對遷移率和分辨率的具體影響：

a. 對遷移率（Mobility）的影響

對于同一大小的(de)(de)DNA片段，瓊脂糖濃度(du)越高，其受到的(de)(de)阻力越大，遷(qian)移(yi)速度(du)越慢。反之(zhi)，濃度(du)越低，遷(qian)移(yi)越快。

因此，在不同濃度的(de)凝膠上(shang)，同一個DNA片段的(de)遷移位置是不同的(de)，不能直接比較。

b. 對分辨率（Resolution）的影響

分辨率是(shi)指將大小相(xiang)近的DNA片(pian)段分離開的能力。這(zhe)是(shi)瓊脂糖濃度最重要的影響。

• 低濃度凝膠（如0.5%-0.8%）：

篩(shai)孔大，允(yun)許大片(pian)段DNA（>10 kb）有(you)效分(fen)離。小片(pian)段DNA跑得飛快，但彼此之間難以分(fen)開，會擠在一(yi)起形(xing)成模糊的一(yi)條帶。

優(you)點：適合分離(li)大片段DNA。

缺點(dian)：凝膠非(fei)常脆(cui)弱柔(rou)軟，容(rong)易破損。

• 中等濃度凝膠（如0.8%-2.0%）：

這(zhe)是最常用的(de)范圍，提(ti)供(gong)了(le)一個良好的(de)平衡，能有效分離0.5 kb - 10 kb范圍內的(de)DNA片段(duan)，足(zu)(zu)以滿足(zu)(zu)大多數常規(gui)實驗（如(ru)質(zhi)粒(li)、PCR產物(wu)、酶切產物(wu)的(de)鑒定）。

1%與(yu)1.7%瓊脂(zhi)糖凝膠外觀對(dui)比

1%與1.7%瓊脂糖凝膠分(fen)辨(bian)率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000;?M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

 

• 高濃度凝膠（如2%-3%）：

篩(shai)孔小，能很(hen)好地分離小片(pian)段DNA（<1 kb），甚至能分辨出幾(ji)十個堿基對的差異。大片(pian)段DNA則(ze)幾(ji)乎無法移動，停留在加樣孔附(fu)近。

優(you)點(dian)：對小片(pian)段DNA分辨率極高。

缺點：凝(ning)膠脆(cui)性(xing)大，易碎。

?? 濃度錯誤直接導致分辨率下降，大片(pian)(pian)段(duan)跑不(bu)動，小片(pian)(pian)段(duan)跑成一團。

 

???常見誤區二：電壓越高越好

瓊脂糖(tang)凝膠電泳里(li)電壓是個很(hen)關(guan)鍵的因(yin)素，直接影響到(dao)DNA/RNA 遷(qian)移速度、條帶(dai)清晰度和分(fen)離效果。

1. 電壓與遷移速度

• 高電壓 → 分子遷移更快：電場力(li)更強(qiang)，帶負電的核酸分子快速向正極移動(dong)。

• 低電壓 → 遷移較慢：分離(li)過程更溫和，條帶移動較(jiao)慢。

2. 電壓與分辨率

• 低電壓（常用 4–6 V/cm）：遷(qian)移慢，但小片(pian)段(duan)與大(da)片(pian)段(duan)的(de)分(fen)離效果(guo)更好，分(fen)辨率高，適合(he)區分(fen)相鄰大(da)小的(de)條(tiao)帶。

• 高電壓（>10 V/cm）：條帶跑得快，但容(rong)易(yi)拉寬、拖尾(wei)，分辨率下降。

4V/cm、7V/cm、9V/cm電壓(ya)分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000

3. 電壓與熱效應

• 高電壓 → 產生焦耳熱：緩沖液升溫(wen)，凝膠(jiao)變軟甚至熔化，導致條帶彎曲（smiling bands，笑(xiao)臉效應）。

• 散熱不足：DNA 遷(qian)移速率不(bu)均勻，上(shang)下(xia)條帶彎曲，DNA降解，影響結果準確性。

• 解決辦法：降低電(dian)壓，或者在低溫條件下(xia)電(dian)泳（冰盒(he)、電(dian)泳槽加冰袋）。

9V/cm電壓下不同電泳時間對比

M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

4. 實驗常用電壓范圍

• 常規瓊脂糖凝膠（0.7–2%）：4–10 V/cm（電壓與電泳槽兩電極間距離有關）。

• 小片段 DNA 分離（幾十到幾百 bp）：可稍(shao)高電(dian)壓（8–10 V/cm）。

• 大片段 DNA（>10 kb）：應低電壓（3–5 V/cm），防止擴散和分(fen)辨率丟失。

電(dian)壓(ya)越高，電(dian)泳(yong)越快，但分辨率(lv)和(he)凝膠完整性(xing)可能受影響(xiang)；低(di)電(dian)壓(ya)遷移(yi)慢，卻能獲(huo)得更(geng)清晰、更(geng)可靠的分離效(xiao)果。

?? 推薦?5–10 V/cm，電極間距 20 cm 時，電壓(ya)保持在 100–200 V 之間。

???常見誤區三：只靠上樣染料定位

上樣(yang)緩沖液是DNA電泳中不可或缺的組成部(bu)分(fen)，它通常(chang)含有(you)兩種(zhong)主要成分(fen)：

1. 惰性染料（如溴酚藍、二甲苯青）：用于實時監控電泳進程。
2. 增稠劑（如甘油、蔗糖、Ficoll）：增加樣品密度，確保樣品沉入加樣孔底部。

染料在電泳中起(qi)到了“視(shi)覺參考線(xian)”或“前(qian)鋒”的作用，其定(ding)位功(gong)能主要(yao)體(ti)現在：

1. 指示電泳進程，統一上樣基準。
2. 預估DNA片段的遷移位置：
   • 不同的染料在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，其遷移行為與特定大小的DNA片段相似。因此，它們可以用來粗略估計未知DNA條帶的大小。
   • 溴酚藍（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與300-500 bp的DNA片段相當。
   • 二甲苯青（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與4000-5000 bp的DNA片段相當。
   • 例如：?如果你看到溴酚藍條帶快跑出凝膠了，你就知道所有小于500 bp的DNA片段可能已經接近凝膠底部，即將跑出。

???不能憑染料位置判斷片段大小，這(zhe)也(ye)是(shi)為什么(me) DNA Marker 在電泳中不可(ke)或缺。

???常見誤區四：Marker 隨便用

在分子生(sheng)物學(xue)實驗中，DNA Marker常被簡單視為泳道中的“對照(zhao)”或“標尺”，但它的作用(yong)遠(yuan)不(bu)止于此。Marker的選擇直接決定了實驗數據的可解釋性、準確性和美觀度，是實驗設計中最容易被忽視卻至關重要的一環。一個不合適的Marker可能導致整個實驗結果失去價值。

低質量或不匹配Marker帶來的三大問題：

1. 片段分布稀疏：導致大小判斷“失準”
   • 問題：?當Marker的條帶間隔過大，或恰好在你目標片段的關鍵區域缺少條帶時，你無法進行精確的插值估算。例如，如果你的PCR產物在750 bp左右，而Marker僅在500 bp和1000 bp有條帶，你只能模糊地估計產物大小在“500到1000 bp之間”，無法得出準確結論。
   • 后果：?實驗數據的精確度大打折扣，無法滿足克隆鑒定、酶切驗證等對大小要求嚴格的實驗需求。
2. 條帶模糊拖尾：影響結果呈現與可信度
   • 問題：?由于保存不當、反復凍融或生產工藝問題，Marker條帶可能出現擴散、模糊或強度不均（有的亮有的暗）。這不僅影響觀察，更嚴重影響成像質量。
   • 后果：?在論文、報告或展示中，模糊的Marker會讓整個實驗結果顯得不專業、不可靠，降低數據的可信度。審稿人或同行可能會因此質疑你的實驗嚴謹性。
3. 缺少關鍵指示條帶：降低實驗效率
   • 問題：?許多高效能的Marker會在500 bp、1000 bp、1500 bp和2000 bp等關鍵位置設置特別亮、特別粗的“指示條帶”或“參考條帶”。
   • 后果：?缺少這些指示條帶，你在快速瀏覽凝膠時就無法瞬間定位。你需要花費額外的時間去數條帶、比對大小，大大降低了實驗分析的效率。尤其在處理多個樣品時，這種效率損失尤為明顯。

如何選擇一個“合理”的Marker？

一個優(you)秀的Marker不應(ying)只是DNA片段的簡單集(ji)合，而應(ying)是一個精心設計的測(ce)量工具。以下是選擇標準：

???1. 覆蓋合適的片段范圍
這是最基本的要求。選擇的Marker其條帶范圍必須將你的目標DNA片段“包圍”在中間，而(er)不(bu)是(shi)落在兩端。例如：

• 常規PCR產物鑒定（100 bp - 2 kb）：?選擇范圍覆蓋100 bp至2000 bp的Ladder，如著名的100 bp Plus Ladder或1 kb Plus Ladder。
• 大片段酶切或基因組DNA分析（>5 kb）：?應選擇λ DNA HindIII digest等大片段Marker。
• 小片段 miRNA/siRNA 分析（<100 bp）：?需要專門的低分子量Marker。

???2. 條帶清晰、濃度均一

• 清晰銳利：?每條帶都應邊界清晰，無拖尾或擴散現象，這表明生產工藝好且保存得當。
• 亮度均一：?理想狀態下，所有條帶應具有相近的亮度（即DNA含量一致），這確保了不同大小的條帶都能被清晰成像，不會出現小條帶看不見、大條帶又過曝的情況。

???3. 含有突出的指示條帶，便于快速定位

• 這是區分“優秀”Marker和“普通”Marker的關鍵。許多高端Marker會特意將500 bp和1000 bp（有時還包括1500 bp和2000 bp）的條帶做得更濃、更亮。
• 好處：?在紫外燈下，你的眼睛能立刻抓住這幾個“地標”，瞬間建立起凝膠的空間距離與分子大小的對應關系，無需仔細數格子，極大提升了判讀效率。

???常見誤區五：忽略緩沖液與染料差異

在瓊脂糖凝膠電(dian)泳中(zhong)，新(xin)手(shou)往往將全部注意力集(ji)中(zhong)在瓊脂糖濃度和電(dian)壓設(she)置上(shang)，而忽略(lve)了兩個同(tong)樣(yang)至關重要的因素：電泳緩沖體系和核酸染料。它們并非“通用”的(de)試劑，其選擇直接影響DNA的(de)遷移率、條帶(dai)分辨率和實(shi)驗(yan)安全(quan)性，錯誤(wu)的(de)選擇會(hui)悄然破(po)壞你的(de)實(shi)驗(yan)結果。

一、電泳緩沖液：不僅僅是導電的溶液

最常用的(de)緩沖液是TAE和TBE，它們(men)化學成分不同(tong)，決定了其特(te)性(xing)和適用場景截(jie)然不同(tong)。

?? 如何選擇？

• 首選TAE的情況：?進行大片段DNA分離（如基因組DNA酶切）、DNA膠回收（兼容性更好）或需要快速電泳時。
• 首選TBE的情況：?進行小片段DNA分離（如PCR產物、SSR分析）、高分辨率電泳（如區分相差幾十bp的條帶）或需要長時間電泳時。

?? 重要提示：絕對不可將TAE和TBE緩沖液或其濃縮母液混用！?這會(hui)導致pH和(he)離子強度異常，產生不可預測的遷移結果。

二、核酸染料：安全與效能的權衡

染料(liao)的(de)(de)選(xuan)擇關(guan)乎實驗結果的(de)(de)清晰度和操作者(zhe)的(de)(de)生命安(an)全。

?? 如何選擇？

• 追求成本與靈敏度：?可能仍在用EB染料，但必須配備嚴格的防護和廢物處理流程。

• 追求安全與便捷（現代實驗室首選）：AIE-Gelgreen或GelRed是更安全的選擇，尤其適合教學實驗室或沒有專門EB處理設施的實驗室。它們通常與藍光成像系統配套，能最大程度減少對DNA的損傷（UV會使DNA產生嘧啶二聚體，影響下游實驗）。
• 注意：?如果實驗下游需要進行膠回收克隆，建議選擇對酶活影響更小的染料。

總結與實驗設計指南

忽(hu)略緩沖(chong)液和染料的(de)(de)(de)選擇，就像用錯誤的(de)(de)(de)尺子和昏暗的(de)(de)(de)燈光(guang)去(qu)測量(liang)一個精細的(de)(de)(de)零件。

?? 在設計實驗時，請遵循這個流程進行選擇：

• 看片段大小：
  • 大片段(>5 kb)?→ 優先選TAE緩沖液。
  • 小片段(<1 kb)?→ 優先選TBE緩沖液，以獲得更高分辨率。
• 看實驗目的：
  • 常規鑒定?→ 可選擇性價比高的方案（如DSView染料、EB染料）。
  • 膠回收?→ 優先選TAE?+?對酶活無抑制的染料（如AIE-Gelgreen）。
  • 發表級高清圖片?→ 優先選高分辨率緩沖液(TBE)?+?高靈敏度/低背景的染料（如AIE-Gelgreen）。

AIE-Gelgreen核酸凝膠染料

• 看安全性與成本：
  • 安全絕對優先?→ 毫不猶豫地選擇AIE-Gelgreen等安全染料和藍光成像系統，即使成本稍高。
  • 權衡遷移準確性 → 如果擔心某些染料影響遷移，可在Marker和樣品中使用完全相同的上樣緩沖液和染料負載，以消除誤差。

因此，將緩沖液和染料視為與凝膠濃度、電壓同等重要的核心實驗參數，根(gen)據(ju)你的具體需求進行理性選擇(ze)，是獲得可靠、美(mei)觀(guan)、安全實驗結果的必備(bei)步驟。

 

??小結

DNA 電泳看似(si)“基礎(chu)”，卻(que)暗藏不少原理性細節。掌握濃度、電壓、緩沖液、Marker 與染(ran)料的(de)選擇規律，才(cai)能保證結果：

• 條帶清晰

• 分辨率高

• 實驗可重復、可展示

 

?東(dong)盛相關產品?

?? 東盛生物提供?高質量 DNA Marker、核酸染料、電泳緩沖液、上樣緩沖液、瓊脂糖等試劑，助力科研人員(yuan)高效、穩定(ding)地完(wan)成核酸電(dian)泳工作。

東盛(sheng)生物DNA Marker (點擊圖片查看詳情)

AIE-Gelgreen核酸凝膠染料?(點擊圖(tu)片查(cha)看(kan)詳情)

 

?訂購咨詢?

廣州東盛生物科技有限公司
?? sales@gdsbio.com
?? 020-87791356
???www.szlsyl.com