PCR（聚合酶鏈式反應）幾(ji)乎(hu)是分子實驗室里最常見(jian)的技術之一(yi)。但有時(shi)候(hou)，做著做著，條帶(dai)(dai)就是不上鏡：要(yao)么(me)(me)無條帶(dai)(dai)，要(yao)么(me)(me)全是拖尾(wei)，要(yao)么(me)(me)陰(yin)性對照還神奇地亮了……??
別急！今(jin)天我(wo)們就來(lai)盤點 PCR失敗的5個常(chang)見原因，并提供實用(yong)的解決辦法，幫你少踩坑。
1???模板DNA質量或(huo)濃度不合(he)適(shi)
?? 表現：無條(tiao)帶、條(tiao)帶過弱或拖尾(wei)。
????? 原因：DNA降解(jie)、雜(za)質殘留，或者濃度過低/過高。
? 解決辦法：
- 保證DNA純度（A260/A280 = 1.8–2.0）；
- 稀釋過濃模板；
- 植物/土壤等樣本建議用高純度提取試劑盒。
2???引物設計或濃度有問題
???表現：非特異性條帶、引物二聚體。
???原因：引物設計不合理，濃度過高/過低。
??解決辦法：
-
長度(du)18–25 bp，GC含量40–60%；
-
避免3’端互補；
-
終濃度(du)一般0.1–0.5 μM，必(bi)要時做梯(ti)度(du)PCR優化。
3???PCR體系或酶活性問題
???表現：完全無擴增或擴增效率低。
???原因：Taq酶失活、Mg2?濃度不合適、dNTP降解。
??解決辦法：
-
分裝(zhuang)保(bao)存酶，避免(mian)反復凍融；
-
優化Mg2?濃(nong)度（1.5–2.5 mM）；
-
用新鮮dNTP；
-
推薦選擇性能優異的PCR預混液??? 預混(hun)液中已(yi)優化了緩沖體系和酶活性，能顯著提升擴(kuo)增成功率，減少反復調試的時間(jian)，非常適合常規科研實驗。
4???實驗操作污染
???表現：陰性對照(zhao)也出現條帶(dai)。
???原因：PCR產物殘留、移液槍污染、空氣中DNA污染。
??解決辦法：
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嚴格分(fen)區(qu)操作（提取(qu)區(qu)/體系配(pei)置區(qu)/產物分(fen)析區(qu)分(fen)開）；
-
用帶濾芯的槍頭；
-
定期(qi)清潔實驗臺(tai)，使用核(he)酸(suan)去(qu)除劑。
5???循環條件設置不當
???表現：條帶模糊、非特異性擴增或無結果。
???原因：退火溫度過低/過高、延伸時間不足、循環數過多。
??解決辦法：
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根據引(yin)物Tm值設置退火溫度；
-
延伸時(shi)間約 1 kb/min；
-
循環(huan)數控制在30–35次。
???總結
PCR失敗并不可怕，常見問題主要集中在?模板、引物、體系、操作和循環條件?這五個方面。逐(zhu)一排(pai)查，總能找(zhao)到原因。
而對于高校實驗室或科研人員來說，選擇一款高性能PCR預混液，往(wang)往(wang)能讓PCR事半功(gong)倍，節省(sheng)大量試錯時間。
?? 科(ke)研路上，少一(yi)點彎路，多一(yi)點高效！
| 貨號 | 產品名稱 | 適用場景 |
| P2141 | Super TaqMix | 常規PCR擴增 |
| P2111 | Super HIFI PCR Master Mix | 長片段高保真擴增 |
| P2121 |
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| P2091 | SYBR Green qPCR Mix | 染料法高特異性基因定量分析 |
| P2701 | Multiplex Probe qPCR Mix Plus U | 探針法多基因同時定量檢測 |
| R1081 | PowerScript RT SuperMix | 全預混高效RNA逆轉錄 |
| RP1001B | 2X One Step RT-PCR Mix | 快速逆轉錄與PCR擴增一體化 |
| V5007 | 2X One Step Prime RT-qPCR Mix | 快速靈敏的轉錄組基因定量檢測 |
| P9013 |
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| R1021 | TRAzol | 高效提取高質量RNA |
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