KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，競爭性等(deng)位基(ji)因特異性PCR）是一(yi)種基(ji)于(yu)PCR的基(ji)因分型(xing)技術，主要用(yong)于(yu)檢測單核苷酸(suan)多態性（SNP）和(he)其(qi)他特定基(ji)因變異。廣泛應用(yong)于(yu)農業育(yu)種、醫學(xue)研究、群體遺(yi)傳學(xue)等(deng)領域。
引物設計開(kai)發流程如下
- 獲取SNP信息，要求兩親本在SNP位置的堿基序列不同，同時該SNP上游20bp、下游40bp無其他SNP, SNP信息可通過全基因組測序得到，也可通過重測序得到；
- 提取親本DNA、F1代DNA
- 引物設計：
- 從SNP所在堿基開始往上游數20bp作為左引物f，SNP的堿基作為左引物的第20個堿基，于是有左引物f1，f2;
- 使用引物設計軟件或引物設計網站（//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）固定左引物f，通過blast得到右引物R，產物大小需小于60bp；
- 左引物f1、f2分別加上接頭A1、A2（接頭序列A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）序列為F1、F2，即F1=A1f1，F2=A2f2；
- 合成序列F1，F2，R，選用ULTRPAGE純化方式；
- 將引物干粉溶解，按比例配制成Primer Mix
- 引物篩選：每種引物每個親本及F1最少跑2個孔。
- 擴增結束后使用熒光定量PCR讀帶：讀帶程序如下：
25℃ for 5s + Plate Read。讀帶完成后，選定熒光類型FAM、HEX、ROX,選擇Allelic Discrimination進行分析 - 挑選其中聚類明顯的引物作為候選標記。
- 將候選標記用于群體，若聚類效果明顯則可作為KASP標記，聚類效果不明顯則不能作為標記。
一般來說，實驗初期需要選擇多個位點設計不同引物進行實際驗證，從中選出聚類效果明顯的作為最終的引物用于實驗。KASP 本身是一個非常依賴引物設計的技術，如果反復優化無果，很可能引物在 SNP 區位的設計可以進一步改善。
配置反應體系
- 模板DNA：通常每個反應加入2.5-25ng/ul高質量DNA可滿足分型需求。具體投入量根據實驗使用物種的基因組大小判斷，遵循大基因組高投入，小基因組低投入原則投入適當DNA。請盡量保持DNA濃度一致。
- 引物：按比例混合 F1、F2、R 各為 10 μM 的 Primer Mix（體積比 1:1:2.5）
- KASP PCR MixPlus : KASP PCR Mix、KASP Probe Mix 全部組分混合振蕩均勻
PCR擴(kuo)增體系(xi)如下(10ul體系(xi))
| Component | Volume |
| DNA | 25-250ng |
| KASP PCR MixPlus | 5ul |
| Primer mix | 0.76ul |
| 超純水 | 補齊至10ul |
陰性對照設置
為(wei)保證(zheng)基因(yin)分(fen)(fen)型數(shu)據的(de)準確(que)性，除測試樣(yang)品(pin)(pin)外，還(huan)應在PCR板(ban)上使用對照(zhao)樣(yang)品(pin)(pin)。建議每個(ge)(ge)基因(yin)分(fen)(fen)型板(ban)上包(bao)含兩個(ge)(ge)NTCs (無模板(ban)對照(zhao))。NTC孔(kong)的(de)熒光信(xin)號強(qiang)度與模板(ban)DNA孔(kong)的(de)信(xin)號強(qiang)度差異可以提(ti)高對基因(yin)分(fen)(fen)型數(shu)據有效(xiao)性的(de)判(pan)定。通常NTC樣(yang)品(pin)(pin)的(de)信(xin)號值應接近(jin)原點，NTC孔(kong)中(zhong)觀察到的(de)任(ren)何擴增都(dou)表(biao)明存在污染或(huo)非特異性擴增，能夠輔助(zhu)分(fen)(fen)型數(shu)據的(de)判(pan)讀(du)。
設定反應程序進行KASP反應
| Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
| Hot-start Taq activation | 95℃ | 1 min | 1 |
| Touchdown | 95℃ | 15 sec | 10 |
| 60→54℃，-0.6℃/循環 | 15 sec | ||
| 72℃ | 20 sec | ||
| Amplification | 95℃ | 15 sec | 26-35 |
| 54℃ | 15 sec | ||
| 72℃ | 20 sec | ||
| Read | 30℃ | 60 sec | 1 |
循環數建議根據物種基(ji)因組大小和(he)投入(ru)量確定(ding)，如(ru)首(shou)次(ci)實驗無成(cheng)熟程序，建議采取26個循環進行初始(shi)反應，后續逐次(ci)增加循環進行最適條件摸索(suo)。
若(ruo)初始PCR擴增(zeng)結束后(hou)未獲得明確基因型(xing)分(fen)簇，可以按照擴增(zeng)循(xun)環條件增(zeng)加3個循(xun)環(94°C 20 sec，57°C 60 sec)，并(bing)再次讀取和分(fen)析(xi)熒光(guang)信號值。若(ruo)分(fen)簇結果仍不夠理想，可以繼續增(zeng)加PCR循(xun)環，直至觀(guan)察(cha)到緊密且分(fen)離良好(hao)的基因型(xing)分(fen)簇為止。
熒光讀取
選定熒(ying)光類型FAM、HEX、ROX,選擇Allelic Discrimination進行分析(xi)（根據實際儀器進行操作）