要先對PCR目(mu)的序列的長度有個大致估計：

第一(yi)步：找到Primer3的站點。你不用記住(zhu)這(zhe)個站點，但是要記住(zhu)“Primer3”這(zhe)個詞，然后打開GOOGLE首(shou)頁，輸(shu)入Primer3，跳(tiao)出來的第一(yi)個項目就是了“”

網址是。

第二步(bu)：貼上模(mo)板序(xu)列(lie)。進入Primer3站點，可以(yi)看到一個引物設計的界面。在“Paste?source sequence?below (5'->3'…..”下面的大(da)空(kong)框里面把你的模(mo)板序(xu)列(lie)粘帖進去。注意是(shi)5'->3'方向的，數字或者空(kong)格都沒關系，軟(ruan)件會(hui)自動過(guo)濾的。

第三步：重要參數設定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調整的就是這個參數。默認的參數實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調整。第二個參數是“Primer Size”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數是”Primer Tm”這個(ge)和Primer Size差不(bu)多。

第四(si)步(bu)：Pick primers：?點一下(xia)這個按鈕，符合你(ni)(ni)大小預期(qi)的(de)primer就出(chu)來了，看(kan)看(kan)Primer3 Output的(de)界面，多么(me)漂亮！你(ni)(ni)要(yao)(yao)的(de)primer出(chu)來了，而且有primer在(zai)序(xu)列上的(de)位(wei)置比對圖，還要(yao)(yao)primer本身(shen)的(de)信(xin)息，包括位(wei)置，長(chang)度(du)，Tm，GC含量，任(ren)何位(wei)置互補(bu)堿(jian)(jian)基(ji)數(shu)(shu)，3'端(duan)互補(bu)堿(jian)(jian)基(ji)數(shu)(shu)，以及引物(wu)序(xu)列，（注意，下(xia)游引物(wu)是(shi)5'->3'），還要(yao)(yao)產物(wu)大小，兩引物(wu)間任(ren)意互補(bu)堿(jian)(jian)基(ji)數(shu)(shu)，兩引物(wu)間3'端(duan)互補(bu)堿(jian)(jian)基(ji)數(shu)(shu)等。如果(guo)引物(wu)尚在(zai)參數(shu)(shu)設定(ding)的(de)范(fan)圍內，但還不是(shi)最佳，將(jiang)會(hui)給出(chu)警(jing)告。

第五步(bu)：引(yin)物設計檢(jian)驗：可(ke)以(yi)(yi)僅僅設計一向引(yin)物，只要(yao)(yao)在Pick?left?primer或者Pick?right?primer前面的(de)(de)勾勾掉一個就可(ke)以(yi)(yi)。也可(ke)以(yi)(yi)自(zi)己定(ding)(ding)義引(yin)物，放在Primer框里(li)，（注意，下游引(yin)物的(de)(de)書(shu)寫反向仍然是(shi)5'->3'）如(ru)果符合設定(ding)(ding)的(de)(de)條件，軟件將對(dui)(dui)給(gei)出引(yin)物評分，同(tong)時給(gei)出警告(gao)信(xin)息(xi)，根據警告(gao)信(xin)息(xi)可(ke)以(yi)(yi)適(shi)當對(dui)(dui)自(zi)定(ding)(ding)義引(yin)物做些調(diao)整即(ji)可(ke)，警告(gao)信(xin)息(xi)也讓你做實(shi)驗的(de)(de)時候心中有數。對(dui)(dui)于(yu)(yu)文(wen)獻(xian)發表(biao)的(de)(de)引(yin)物，最好(hao)都要(yao)(yao)檢(jian)查一下，這(zhe)樣(yang)就可(ke)以(yi)(yi)避免被別(bie)人有意無意誤(wu)導。至于(yu)(yu)RT-PCR所用的(de)(de)引(yin)物，最好(hao)是(shi)使得產物跨過內含(han)子(zi)(zi)，這(zhe)樣(yang)避免潛在DNA對(dui)(dui)RT-PCR的(de)(de)干擾。實(shi)際做引(yin)物的(de)(de)時候，要(yao)(yao)把內含(han)子(zi)(zi)都去掉，僅僅把外(wai)顯子(zi)(zi)序(xu)列放入(ru)源序(xu)列框中，并且通過自(zi)定(ding)(ding)義引(yin)物設計的(de)(de)方(fang)法，使上下游引(yin)物分別(bie)全(quan)部或者部分落在不同(tong)外(wai)顯子(zi)(zi)上。至于(yu)(yu)如(ru)何快速(su)識別(bie)內含(han)子(zi)(zi)和外(wai)顯子(zi)(zi)以(yi)(yi)及電子(zi)(zi)PCR，我(wo)將抽空另做說(shuo)明。

至(zhi)于(yu)設計出來的(de)(de)引物(wu)的(de)(de)實際效(xiao)果，根據(ju)我的(de)(de)經驗，一(yi)(yi)般情(qing)況下都(dou)能(neng)做(zuo)到PCR一(yi)(yi)次成功(gong)，也許(xu)隨便那(nei)一(yi)(yi)段(duan)序列做(zuo)引物(wu)也能(neng)達到很好的(de)(de)效(xiao)果，但是不管怎么說，軟件(jian)做(zuo)引物(wu)可以讓自己心中有數。最后(hou)，GOOD LUCK TO EVERYONE.