FS? Mix Direct for Tissue

Cat. #：P2071b，P2072b

產品簡介

FS??Mix Direct for Tissue是(shi)適合(he)組織樣本(ben)擴(kuo)增的(de)(de)(de)(de)(de)2×濃縮(suo)快(kuai)速(su)高(gao)效(xiao)PCR預混合(he)溶(rong)液(ye)(ye)，含有FS? Taq DNA聚合(he)酶、dNTP混合(he)物、緩沖液(ye)(ye)等PCR擴(kuo)增必(bi)需組分（模(mo)板與引物除外）。使用(yong)時，僅(jin)需在擴(kuo)增體(ti)系(xi)中(zhong)加(jia)入簡單處理后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)樣本(ben)處理液(ye)(ye)和(he)引物即可(ke)進行(xing)PCR，從而可(ke)以極大(da)地簡化(hua)(hua)操(cao)作過程，縮(suo)短操(cao)作時間，降低污染（加(jia)樣次(ci)數減(jian)少）。FS??Mix Direct for Tissue的(de)(de)(de)(de)(de)反應體(ti)系(xi)經(jing)過優化(hua)(hua)處理，高(gao)靈(ling)敏(min)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)FS??Taq DNA聚合(he)酶確保處理液(ye)(ye)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)微量(liang)樣本(ben)得到高(gao)效(xiao)擴(kuo)增。本(ben)產品不用(yong)進行(xing)繁瑣的(de)(de)(de)(de)(de)DNA提(ti)取，最(zui)大(da)限度(du)減(jian)少實驗誤差和(he)交(jiao)叉污染；同時依靠特(te)殊的(de)(de)(de)(de)(de)緩沖體(ti)系(xi)增強(qiang)PCR擴(kuo)增的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)異性，保證擴(kuo)增效(xiao)果與DNA模(mo)板擴(kuo)增效(xiao)果同樣可(ke)靠。

FS??Taq DNA聚合酶是根據蛋白工程原理，以Taq DNA聚合酶為基礎，研發設計的新一代DNA聚合酶。本產品具有類似KOD酶的快速擴增能力，延伸速度為20s/kb（70~75℃，簡單模板可達5s/kb）。是普通Taq DNA聚合酶的3倍，可縮短一半以上的擴增時間；同時具備Taq DNA聚合酶擴增效率高、適應性廣等優點。FS??Taq DNA聚合酶使用方法與普通Taq DNA聚合酶基本相同，只需注意適當縮短延伸時間。該酶具有5'→3'聚合酶活性，無3'→5'外切酶活性。擴增產物具有3'-dA突出端，可直接用于TA克隆。

產品組成

本產(chan)品分體系(xi)中包(bao)(bao)(bao)含(han)溴(xiu)酚藍(lan)、不含(han)溴(xiu)酚藍(lan)兩(liang)類(lei)。體系(xi)中包(bao)(bao)(bao)含(han)溴(xiu)酚藍(lan)的產(chan)品，PCR擴(kuo)(kuo)增產(chan)物可直接電泳檢測。這兩(liang)類(lei)產(chan)品的擴(kuo)(kuo)增性能無(wu)差異。如無(wu)特(te)別(bie)說明提(ti)供體系(xi)中包(bao)(bao)(bao)含(han)溴(xiu)酚藍(lan)的包(bao)(bao)(bao)裝。

保存條件

-20℃保存2年。

質量控制

純(chun)度檢測：經(jing)質量(liang)檢測，產(chan)品不含脫(tuo)氧(yang)核糖核酸內切酶(mei)、脫(tuo)氧(yang)核糖核酸外切酶(mei)和(he)核糖核酸酶(mei)污染。

功能(neng)檢測(ce)：PCR方法檢測(ce)無宿(su)主殘余DNA，能(neng)有效擴增人(ren)基因(yin)組中(zhong)的單拷貝基因(yin)。

應用舉例

1.?處理樣品

組織：取3-5mg組(zu)織置于1.5ml離(li)心管中，加(jia)入(ru)180 μl Extraction?Solution，充分渦(wo)旋振蕩，95℃溫浴10min。加(jia)入(ru)20 μl?Neutralization?Solution，充分渦(wo)旋振蕩，5,000rpm離(li)心2min，取0.5-2 μl上清進行擴增。

頭發：取(qu)兩根帶(dai)毛(mao)(mao)囊(nang)的頭(tou)發(fa)，剪下(xia)帶(dai)毛(mao)(mao)囊(nang)的發(fa)根放(fang)入(ru)1.5ml離心(xin)管(guan)中，加入(ru)180 μl Extraction?Solution，充(chong)分渦(wo)旋振蕩，95℃溫浴10min。加入(ru)20 μl?Neutralization?Solution，充(chong)分渦(wo)旋振蕩，5000rpm離心(xin)2min，取(qu)0.5-2 μl上清進行擴(kuo)增。

口腔拭子：取樣前30min內請勿進(jin)(jin)食(shi)及飲(yin)水，使用(yong)無菌棉(mian)簽在(zai)口腔內擦拭10次。將棉(mian)球剪下置于1.5ml離(li)心管中，加入(ru)180 μl Extraction? Solution，充分渦(wo)(wo)旋振蕩，95℃溫浴10min。加入(ru)20 μl?Neutralization?Solution，充分渦(wo)(wo)旋振蕩，5,000rpm離(li)心2min，取0.5-2 μl上清進(jin)(jin)行擴增。

培養細胞：如果是懸浮培養細胞直接取1×10³-10⁴當量的細胞加入(ru)到50 μl?PCR反應體系(xi)中即可。如果是貼(tie)壁培養細胞，取(qu)3-5mg細胞組織置于1.5ml離心管中，加入(ru)180 μl Extraction?Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入(ru)20 μl?Neutralization?Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取(qu)0.5-2 μl上(shang)清進行擴增(zeng)。

血液、淋巴液DNA病毒：取(qu)(qu)100 μl血清(qing)或淋巴(ba)液至1.5ml離心管(guan)中，加入180 μl Extraction?Solution，充分渦旋(xuan)振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl?Neutralization? Solution，充分渦旋(xuan)振蕩，12,000rpm離心10min，取(qu)(qu)0.5-2 μl上清(qing)進行擴增。

2.?配制反應體系

請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：

[1]?引(yin)物終濃(nong)度(du)建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時(shi)可降(jiang)低濃(nong)度(du)，效率低時(shi)可提高濃(nong)度(du)。

[2]?可單獨訂(ding)購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。

[3]?可單獨訂購25mM MgCl₂（Cat. #：P9031）和PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。

3.?設定反應程序進行PCR反應

大多數模(mo)板(ban)的(de)快(kuai)速擴增條(tiao)件：

[1]?退火溫(wen)度應根據Tm值(zhi)較(jiao)低的引物來(lai)設。

[2]?延伸時(shi)間按20 sec/kb來設(she)最佳。

1kb簡單模板的(de)快速(su)擴增條件：

由于1kb簡單(dan)模板的二級(ji)結構簡單(dan)，且長度較(jiao)短(duan)，可同時縮短(duan)變(bian)性、退火時間(jian)至15s，延(yan)伸時間(jian)20s，以實現快速擴(kuo)增。

4.?分析結果

反應產物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要，可進行割膠回收。無產物或產物量少的改進措施有：1調整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分，需要高倍稀釋（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl₂（Cat. #：P9031）等可提(ti)高產量。

操作注意事項

處理的組織樣本往往不會完全溶(rong)解，這是正(zheng)常現象。溶(rong)解在處理液中(zhong)的組織樣本足(zu)夠(gou)滿足(zu)FS??Mix Direct for Tissue擴(kuo)增的需要。

室溫下FS??Taq DNA聚合酶有(you)一定(ding)的活性，為(wei)避免發(fa)生非特異性擴(kuo)增，請于冰上配置反應(ying)體系(xi)，并且最后添加模(mo)板DNA。

延(yan)(yan)伸(shen)時間視(shi)片(pian)段(duan)長度(du)而定。一般情況，≤500bp目的片(pian)段(duan)延(yan)(yan)伸(shen)15s，500bp-1kb延(yan)(yan)伸(shen)20s，＞1kb延(yan)(yan)伸(shen)時間按20s/kb計(ji)算。

FS? Taq DNA聚合酶(mei)具(ju)有脫氧(yang)核(he)苷(gan)酸(suan)轉移酶(mei)活性，因此在PCR產物3’末端(duan)通常會加上一個多余的(de)脫氧(yang)腺嘌呤核(he)苷(gan)，可(ke)進行(xing)TA克(ke)隆(long)。

FS??Mix Direct for Tissue也可采(cai)用常(chang)規程序擴(kuo)增(zeng)。

引物設計注意事項

引(yin)(yin)物(wu)長度一般在(zai)(zai)15-30個(ge)堿基之間(jian)(jian)；上下游(you)(you)引(yin)(yin)物(wu)3’末端避免互補，避免出現3個(ge)以上重復(fu)的(de)G或C，或出現發夾結構，否則會產生非(fei)(fei)特異性擴增；GC含量(liang)控制在(zai)(zai)40-60%，且(qie)上下游(you)(you)引(yin)(yin)物(wu)GC含量(liang)盡(jin)量(liang)接(jie)近(jin)；Tm值控制在(zai)(zai)55-65℃之間(jian)(jian)，且(qie)上下游(you)(you)引(yin)(yin)物(wu)Tm值盡(jin)量(liang)接(jie)近(jin)，額外附加序列(lie)（酶(mei)切位點、修飾等(deng)）是(shi)非(fei)(fei)模板(ban)匹配(pei)序列(lie)，不參與Tm值計(ji)算。

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