通用RNA提取試劑盒
產品組分
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貨號 |
R1051（50?次） |
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溶液?RL |
60 ml |
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溶液?RPI |
18 ml |
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溶液?RW |
12 ml |
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DEPC處理水 |
10 ml |
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RNase-free?純(chun)化柱 |
50?個 |
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RNase-free?離心管 |
50?個 |
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說明書 |
1?份 |
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需要自備的溶液
●??氯仿
●??無水乙醇
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產品說明
通用RNA提取試劑盒是經過改進開發的新一代產品，提高了裂解液的裂解能力和提取的靈敏度，通過在特定適宜的條件下特異、可逆地結合RNA，而各種蛋白質和其他雜質均可被去除掉，同時改進的硅基質膜增強了對RNA的吸附能力，得到的RNA純度更好，質量更高。該試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，每個吸附柱每次可處理50–100 mg?組織或5×106?細胞，可(ke)同(tong)時(shi)(shi)處理(li)大量不同(tong)樣品，一(yi)個小時(shi)(shi)內即可(ke)完成反應。提取的總RNA沒(mei)有DNA和蛋(dan)白的污(wu)染，可(ke)用于Northern blot、Dot blot、polyA?篩選(xuan)、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等。
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保存條件
溶(rong)液(ye)RL應在2-8℃避光保存(cun)，其他溶(rong)液(ye)和純化(hua)柱室溫保存(cun)。
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注意事項---------------------------------------------------------------------------------------------------------
●??初次使用溶(rong)液(ye)RPI和溶(rong)液(ye)RW前，需按(an)比例加(jia)入無(wu)水乙醇。18 ml溶(rong)液(ye)RPI中加(jia)入12 ml無(wu)水乙醇（3:2），12 ml溶(rong)液(ye)RW中加(jia)入48 ml無(wu)水乙醇（1:4）。
●??嚴防(fang)操(cao)作環境(jing)、使用的容器、耗材和試(shi)劑的RNase污染。操(cao)作過程中勤換手(shou)套(tao)。
●??使用本產品提(ti)取(qu)的RNA一般不含有DNA污染(ran)。在極少數情況下（與組(zu)織pH值等相(xiang)關），如果(guo)有DNA污染(ran)而又必須去除(chu)，則可以用RNase-free的DNase處理(li)樣(yang)品。
●??請嚴(yan)格遵照操作(zuo)步驟(zou)操作(zuo)。
●??不同起始(shi)材料的(de)用(yong)量(liang)及溶(rong)液RL的(de)用(yong)量(liang)不同（參(can)見(jian)下表），過多或過少(shao)(shao)的(de)使用(yong)量(liang)都可能(neng)影響RNA的(de)質量(liang)或產量(liang)。若起始(shi)材料量(liang)很少(shao)(shao)，RNA預計產量(liang)很低，在異丙(bing)醇(chun)沉淀時，可加(jia)入20mg/ml的(de)肝糖原溶(rong)液0.5-1 μl促進RNA沉淀。
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樣品用量 |
溶液RL的用量 |
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10cm2的貼壁培養細胞 |
1 ml |
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107的懸浮培養細胞 |
1-2 ml |
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100 μl的白細胞 |
2 ml |
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50-100 mg的普通組織樣品 |
1 ml |
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50-100 mg的(de)特殊組(zu)織樣(yang)品（肝、脾、骨(gu)及軟骨(gu)等） |
2 ml |
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15-30 mg的植(zhi)物材料（多糖(tang)和多酚(fen)含量不高的） |
1 ml |
●??有關RNA的吸光(guang)度說明(ming)如(ru)下：
260nm、320nm、230nm、280nm下的(de)吸光度分別代表核酸(suan)(suan)、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白(bai)質等(deng)有(you)機物的(de)污染程度，質量較好的(de)RNA的(de)R值(zhi)應(ying)在1.8-2.0之間，當R<1.8時，溶液中的(de)蛋白(bai)質等(deng)有(you)機物的(de)污染比較明(ming)顯；當>2.2時，說明(ming)RNA已經被水解(jie)成單核苷酸(suan)(suan)。
●??RNA濃度=（OD260-OD320）*稀釋倍數(shu)*0.04 μg/μl。
操作步驟---------------------------------------------------------------------------------------------------------
第一次使用前應在溶(rong)液?RPI、溶(rong)液?RW中加(jia)入(ru)(ru)無水乙(yi)醇(chun)，加(jia)入(ru)(ru)量(liang)請參(can)見瓶上(shang)標簽。
1. ?樣品處理
●?組織：將組織在液氮中磨碎。每50–100 mg組織加1 ml溶(rong)液RL，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品(pin)體積(ji)不(bu)應超(chao)過溶(rong)液RL體積(ji)的十分之一。
●?單層培養細胞：直接在培養板中加入溶液RL裂解細胞，每10 cm2?面積加1 ml溶液RL。用取樣器(qi)抽打幾次(ci)。
●??溶液RL的加(jia)入(ru)量根(gen)據培(pei)養瓶(ping)面(mian)積決(jue)定，不(bu)是由細(xi)胞(bao)數決(jue)定。如果加(jia)量不(bu)足，可能(neng)導致提取的RNA中有DNA污染。
c. ?細胞懸液：離心取細胞，棄上清。每5–10×106動物細胞(bao)(bao)和植物細胞(bao)(bao)加入(ru)1 ml溶液RL。加溶液RL前不要洗滌細胞(bao)(bao)，以免降解mRNA。
2. ?將勻(yun)漿樣品在15–30℃放置5 min，使(shi)得核酸(suan)蛋(dan)白復合物(wu)完全分離。
3. ?可選步驟：4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)?離心5分鐘(zhong)，取上(shang)清，轉入一個新的無RNase的離心管中(zhong)。
●??如果樣品中含有較多(duo)蛋白、脂(zhi)肪(fang)、多(duo)糖(tang)或(huo)肌肉(rou)、植物結節部分等(deng)，可(ke)加此步驟離心(xin)去除。離心(xin)得到的沉淀中包括細(xi)胞外膜(mo)、多(duo)糖(tang)、高分子量DNA，RNA存在于(yu)上(shang)清溶液(ye)中。
（如樣品含有較多多糖多酚，請增加以下步驟，在上清液中加入(ru)(ru)0.2×上清液體積(ji)(ji)的5 M NaCl及1×上清液體積(ji)(ji)的酚/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm?離心(xin)5-10 min?，取上清液加入(ru)(ru)等體積(ji)(ji)氯仿，混勻，12000 rpm?離心(xin)5-10 min，至第4步。）
4. ?加入200 μl氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室(shi)溫放置3 min。
5. ?4℃ 12,000 rpm離心10 min，樣(yang)品(pin)會(hui)分成(cheng)三層(ceng)(ceng)，從上至下依次(ci)是：無(wu)色的(de)水(shui)相(xiang)，白色的(de)中(zhong)(zhong)間層(ceng)(ceng)和黃色的(de)有機(ji)相(xiang)，RNA主(zhu)要存在于水(shui)相(xiang)中(zhong)(zhong)，水(shui)相(xiang)的(de)體(ti)積約(yue)為所用溶液RL試劑(ji)的(de)60%。把水(shui)相(xiang)轉移到新管中(zhong)(zhong)，進行下一步操作。注意不(bu)要吸(xi)到中(zhong)(zhong)間層(ceng)(ceng)。
●??第一次使(shi)用前應在溶(rong)液(ye)?RPI、溶(rong)液(ye)RW中加(jia)入無水乙醇，加(jia)入量請參(can)見瓶(ping)上(shang)標簽。
6. ?緩慢加入0.5?倍體積無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到溶液和沉淀一起轉入純化柱中，4℃ 12,000 rpm離心30 s。4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄掉收集管中的廢液。
●??若溶液體積(ji)大于純(chun)化柱容積(ji)（700 μl），可(ke)分兩(liang)次離心。
7. ?向純化柱中加入500 μl溶液RPI（使用前請先檢查是否已加入乙醇），4℃ 12,000 rpm離(li)心30 s，棄廢液。????
8. ?向純化柱中加入500 μl溶液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min，?4℃ 12,000 rpm離(li)心30 s，棄廢液。
9. ?向純化柱(zhu)中加(jia)入500 μl溶(rong)液RW，室溫靜置(zhi)2分鐘，4℃ 12,000 rpm離(li)心30 s，去除(chu)殘余液體。
10. ?將純化(hua)柱放(fang)入2ml收集管中，4℃ 12,000 rpm離(li)心2 min，去除(chu)殘余(yu)液體。
●??此步驟的(de)目(mu)的(de)是將(jiang)純(chun)化柱中殘余的(de)漂(piao)洗(xi)液去除，離(li)心后將(jiang)純(chun)化柱在室溫(wen)放(fang)置(zhi)片(pian)刻，或置(zhi)于(yu)超凈工作(zuo)(zuo)臺(tai)上通風片(pian)刻，以充分晾(liang)干。如果有漂(piao)洗(xi)液殘留，可(ke)能(neng)會影(ying)響后續的(de)RT等實驗操(cao)作(zuo)(zuo)。
11. ?將純化柱轉入一個新的離心管中，加30–100 μl RNase-free ddH2O，室溫放置2 min，4℃ 12,000 rpm離心2 min。
●??洗脫緩沖液體積不應少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應(ying)保存在(zai)-70℃（-80℃），以(yi)防降(jiang)解。
●??如果想(xiang)提高RNA得率，可重復(fu)上(shang)步操作(zuo)一(yi)次，合并兩(liang)次得到的溶(rong)液。
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