M-MLV?逆轉錄酶

產品說明

M-MLV逆(ni)轉錄(lu)酶(mei)(mei)是由一(yi)個?71 kD的(de)單亞(ya)基組(zu)成的(de)重組(zu)型DNA逆(ni)轉錄(lu)聚合(he)酶(mei)(mei)。可以催(cui)化以RNA或DNA：RNA雜交鏈(lian)為模板的(de)互補DNA?的(de)聚合(he)反應。本酶(mei)(mei)經修飾RNase H活性比(bi)普通的(de)逆(ni)轉錄(lu)酶(mei)(mei)要弱很多，因此在合(he)成第一(yi)鏈(lian)cDNA的(de)過程(cheng)中(zhong)，可保證RNA的(de)降解(jie)程(cheng)度較低，從而使得率提高。

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產品組分

R1041可(ke)進行25次逆轉錄反應(ying)，R1042可(ke)進行50次逆轉錄反應(ying)（20 μl?標準(zhun)?PCR?反應(ying)體(ti)系，每次使用(yong)?M-MLV 1 μl）。

M-MLV?儲存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，200 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.01% NP-40，50% glycerol

5x first-strand buffer?成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，375 mM KCl，15 mM MgCl₂，50 mM DTT

保存條件

-20℃保(bao)存，避免反復(fu)凍融(rong)。

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質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[₃₂P]dCTP作(zuo)為(wei)標記，200 U的(de)M-MLV以1μg、1.2 kb的(de)RNA為(wei)模板進行逆轉錄反應，最(zui)低可得(de)到120 ng的(de)cDNA，所得(de)cDNA長(chang)度?>?全(quan)長(chang)的(de)90%。

核酸外切酶活性檢測

混合(he)50 ng的(de)標記DNA或RNA與200 U M-MLV在1×反應(ying)緩沖液體系(xi)中，37℃溫浴1 h，檢測DNA和RNA降解都不到總量的(de)1%。

核酸內切酶活性檢測

混合1μgⅠ型超(chao)螺旋(xuan)質粒DNA與500 U M-MLV在1×反(fan)應(ying)緩(huan)沖液體系中，37℃溫浴1 h，瓊脂糖電泳(yong)檢測，無明顯的剪切。

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適用范圍

第一(yi)鏈cDNA?合(he)成；cDNA?文庫構建；RT-PCR；引物(wu)延(yan)伸；3'?和?5' RACE。

注意事項

l??成(cheng)功的cDNA合成(cheng)來自高(gao)質量的RNA。高(gao)質量的RNA至少(shao)應保證全長的完(wan)整性并且(qie)不含(han)逆轉錄酶的抑(yi)制(zhi)劑，如(ru)EDTA或?SDS。用(yong)于cDNA合成(cheng)反應的溶液(ye)試劑盡可能(neng)用(yong)DEPC進行(xing)處理(li)，并在高(gao)壓(ya)滅(mie)菌后使用(yong)。有些試劑不能(neng)用(yong)高(gao)壓(ya)滅(mie)菌處理(li)時，首(shou)先用(yong)經(jing)過(guo)滅(mie)菌的器具、水等配制(zhi)溶液(ye)后，再(zai)將(jiang)溶液(ye)進行(xing)過(guo)濾(lv)除菌處理(li)。

l??為了增加(jia)貯(zhu)存RNA樣品(pin)的(de)穩定性，可(ke)以(yi)將RNA溶解(jie)在去離(li)子的(de)甲酰(xian)胺中，存于-70℃。用于保存?RNA?的(de)甲酰(xian)胺一定不能含有降(jiang)解(jie)RNA的(de)雜物(wu)。來(lai)源(yuan)于胰臟的(de)RNA至少(shao)可(ke)以(yi)在甲酰(xian)胺中保存一年(nian)。當(dang)準備使用RNA時，可(ke)以(yi)使用下列方法沉淀RNA：加(jia)入(ru)NaCl至0.2 M同時加(jia)入(ru)4倍(bei)體(ti)積的(de)乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離(li)心5 min。

l??在(zai)(zai)逆(ni)轉錄反(fan)(fan)應(ying)中經常(chang)加(jia)入(ru)RNase抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)（RNasin）以增加(jia)cDNA合成(cheng)(cheng)(cheng)的(de)(de)長度(du)和產量。在(zai)(zai)第(di)一鏈合成(cheng)(cheng)(cheng)反(fan)(fan)應(ying)中，RNase抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)在(zai)(zai)緩沖液和還原劑(ji)(ji)（如?DTT）存在(zai)(zai)的(de)(de)條件下加(jia)入(ru)，因為cDNA合成(cheng)(cheng)(cheng)前的(de)(de)過程會使(shi)抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)變性，從(cong)而(er)釋放出RNase。但(dan)是(shi)RNase抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)僅(jin)防(fang)止RNase A，B，C?對RNA的(de)(de)降解，并(bing)不(bu)能(neng)防(fang)止皮膚上的(de)(de)RNase，因此盡(jin)管使(shi)用了RNase抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)，也要小心不(bu)要從(cong)手指上引入(ru)RNase。

l??較(jiao)高的保溫溫度(du)有助于RNA二級結構的打開(kai)，增加反應的產量。

l??使用簡單的(de)(de)RNA純化方法即可獲得滿足(zu)RT-PCR反應的(de)(de)RNA，但為了保證(zheng)實驗的(de)(de)成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制(zhi)備(bei)的(de)(de)高純度RNA。

l??為防止RNA降(jiang)解，應盡量避(bi)免(mian)反復凍融，最好保存于(yu)-70℃。

l??最(zui)佳的(de)PCR反應(ying)(ying)條件(jian)，因PCR擴增(zeng)儀的(de)不同而(er)不同，所以在(zai)使用您的(de)樣品之前最(zui)好先試做一下control反應(ying)(ying)，以確定最(zui)佳的(de)PCR反應(ying)(ying)條件(jian)。

l??cDNA產(chan)物應(ying)置于-20℃保(bao)存(cun)。

l??當以cDNA為模板(ban)進行PCR之前，使(shi)用RNase H處理cDNA，可以提高PCR反應的靈(ling)敏度。

操作步驟

1?在冰浴(yu)的(de)無菌離心管中配制下列混合物

2?進行(xing)變性退火反應(ying)

70℃溫浴5 min，簡短離心后冰(bing)浴5 min。

3?在上述離心(xin)管中配(pei)制反轉錄反應液

4?按下(xia)列條件進行反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅?：42℃溫(wen)浴60 min；

Random primer：?37℃溫浴60 min。

5?終止反應

70℃溫浴(yu)5 min終止(zhi)反應，置冰(bing)上進(jin)行(xing)后續實(shi)驗(yan)或-20℃保存。

6?用RNase-free ddH₂O將反(fan)應體系(xi)稀釋到(dao)50μl，取2-5μl進行PCR擴(kuo)增(zeng)反(fan)應。